Introducción
Calcular la incertidumbre de medición en los laboratorios de microbiología se ha convertido en un gran desafío. Con la entrada en vigor de la Ley de Modernización de la Inocuidad Alimentaria , ha aumentado significativamente el número de laboratorios de microbiología alimentaria que solicitan la acreditación ISO/IEC 17025. Sin embargo, no existe mucha información, guías ni cursos útiles para enseñar la incertidumbre de medición en los laboratorios de microbiología.
Por lo tanto, he creado esta guía para ayudar a los laboratorios de microbiología de alimentos a aprender a calcular la incertidumbre de la medición.
Microbiología de Alimentos y Acreditación ISO/IEC 17025
En 2011, se promulgó la Ley de Modernización de la Inocuidad Alimentaria para implementar nuevas regulaciones que garanticen la inocuidad alimentaria. Uno de los requisitos exigía que las pruebas de alimentos fueran realizadas por laboratorios acreditados según la norma ISO/IEC 17025 y exigía a la FDA que estableciera un programa de cumplimiento.
En 2015, la FDA autorizó el uso de organismos de certificación de terceros para realizar auditorías de seguridad alimentaria .
Como resultado, el número de laboratorios de microbiología de alimentos que buscan la acreditación ISO/IEC 17025 ha aumentado significativamente.
Incertidumbre de medición en microbiología alimentaria
Durante años, muchos laboratorios de microbiología de alimentos han estado realizando pruebas y emitiendo resultados sin estimaciones de la incertidumbre de la medición.
Según encuestas y entrevistas a clientes, el 88% de los laboratorios de microbiología participantes no estimaron la incertidumbre porque afirmaron que un auditor o consultor les había informado que no era necesario.
Sorprendentemente, esta filosofía funcionó cuando sus laboratorios de microbiología recibieron la acreditación ISO/IEC 17025.
Sin embargo, cada laboratorio de microbiología encuestado había sido citado durante una evaluación (en los últimos 2 años) por no estimar la incertidumbre.
Confundidos y frustrados, la mayoría se pregunta por qué han cambiado las reglas. Además, quieren aprender a estimar la incertidumbre.
Entonces, ¿qué significa esto para usted?
Bueno, si usted es un laboratorio de microbiología de alimentos que busca la acreditación ISO/IEC 17025, es posible que desee considerar la posibilidad de que necesite calcular la incertidumbre de los resultados de sus pruebas.
Para ayudarle a decidir, A2LA cuenta con una política para la estimación de la incertidumbre de medición en laboratorios de análisis de ciencias biológicas . Esta política es una excelente referencia para determinar qué métodos de prueba requieren una estimación de la incertidumbre y cuáles no.
Además, A2LA ha publicado una excelente guía para la estimación de mediciones en laboratorios de microbiología . He utilizado esta guía para ayudar a varios laboratorios de microbiología de alimentos a calcular la incertidumbre de medición.
¡De hecho, fue la inspiración para esta guía!
Incertidumbre en microbiología
En esta guía, te enseñaré cuatro formas de calcular la incertidumbre de medición para métodos microbiológicos.
Además de la guía A2LA, he añadido más detalles para ayudarte a comprender cómo calcular la incertidumbre. Además, he creado una calculadora de incertidumbre de Microsoft Excel basada en los cuatro métodos, que puedes descargar aquí .
Aquí tienes una lista de métodos que aprenderás leyendo esta guía. Para ir más allá, haz clic en el enlace de abajo.
1. Réplicas de reproducibilidad para muestras de control de laboratorio
2. Réplicas de recuperación para muestras de control de laboratorio
3. Muestras de control de laboratorio con los mismos valores objetivo
4. Datos de validación del método de laboratorio
Método 1
Réplicas de reproducibilidad para muestras de control de laboratorio
Este método estima la incertidumbre de medición para procesos u observaciones replicados mediante el análisis del mismo tipo de matriz de muestra. El objetivo es utilizar pruebas de reproducibilidad para evaluar cómo diversas fuentes de incertidumbre afectan el muestreo rutinario en diferentes condiciones.
Algunas variables que puedes cambiar para realizar pruebas de reproducibilidad;
- Días diferentes
- Diferentes analistas
- Diferentes equipos
- Diferentes reactivos
Puede encontrarse más información sobre este método en ISO TS19036: Microbiología de alimentos y piensos para animales. Directrices para la estimación de la incertidumbre de la medición para determinaciones cuantitativas .
En la imagen a continuación, verá una captura de pantalla de la calculadora de incertidumbre que creé en Microsoft Excel para estimar la incertidumbre utilizando este método.
Para estimar la incertidumbre de la medición en microbiología utilizando réplicas, realice los siguientes pasos que se describen a continuación.
1. Convertir datos sin procesar a un valor de base logarítmica 10
En el primer paso, deberá convertir sus datos sin procesar a valores logarítmicos en base 10. Esto se logra fácilmente utilizando la siguiente función de Excel:
=LOG10(Celda1)
Asegúrese de convertir tanto la primera como la segunda réplica.
2. Calcule la media general o promedio de los valores del logaritmo en base 10
En este paso, deberá calcular la media (es decir, el promedio) de todos los valores de Log Base 10 que calculó en el paso 1. Por lo tanto, asegúrese de incluir valores de Log Base 10 tanto para la primera como para la segunda réplica.
Esto se puede realizar en Excel utilizando la siguiente función;
=PROMEDIO(Celda1:Celdan,Celda1:Celdan)
3. Calcular la diferencia entre las réplicas convertidas
A continuación, calculará la diferencia entre los valores de Log base 10 para los conjuntos A y B. Para ello, simplemente reste el valor de Log base 10 de A por el valor de Log base 10 de B.
=CélulaA-CélulaB
4. Calcule la desviación estándar agrupada
Ahora, deberá calcular la desviación estándar combinada. Este paso puede ser un poco complejo, así que lo desglosaré.
1. Calcule la suma de cuadrados para los valores calculados en el paso 3.
2. Divida el resultado por 2n o 2 multiplicado por el número de muestras.
3. Calcula la raíz cuadrada del resultado.
Para hacer esto más fácil, puedes utilizar la siguiente ecuación en Excel;
=RAÍZ(SUMACUADROS(Celda1:Celdan)/(2*CONTAR(Celda1:Celdan)))
5. Calcular la desviación estándar relativa
Ahora que ha calculado la media y la desviación estándar combinada, el siguiente paso será calcular la desviación estándar relativa. Esto se realiza dividiendo la desviación estándar entre la media.
El resultado calculado será un porcentaje.
6. Elija un factor de cobertura
Antes de calcular la incertidumbre expandida, debe elegir un factor de cobertura que le proporcione aproximadamente un 95 % de confianza. Puede optar por usar un factor de cobertura de 2 o usar la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura adecuado según sus grados de libertad.
CONSEJO PROFESIONAL: Si tiene 20 o más muestras, generalmente es aceptable utilizar un factor de cobertura de 2. De lo contrario, se recomienda que utilice la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura apropiado para el tamaño de su muestra.
7. Calcule la incertidumbre relativa expandida
Por último, calcule la incertidumbre expandida multiplicando su factor de cobertura (k) y la desviación estándar relativa.
Método 2
Réplicas de recuperación para muestras de control de laboratorio
Este método estima la incertidumbre de medición en mediciones microbiológicas mediante la evaluación de la recuperación a lo largo del tiempo . El objetivo es utilizar las diferencias de recuperación a lo largo del tiempo para determinar cómo diversas fuentes de incertidumbre afectan los resultados de las pruebas.
Este método se recomienda cuando se supone que la recuperación es razonablemente constante para un organismo particular en una matriz dada.
Algunas fuentes de incertidumbre que deben analizarse utilizando este método;
- Error aleatorio
- Diferentes analistas
- Diferentes equipos
- Diferentes condiciones ambientales
En la imagen a continuación, verá una captura de pantalla de la calculadora de incertidumbre que creé en Excel para estimar la incertidumbre utilizando este método.
Para estimar la incertidumbre de la medición en microbiología utilizando diferencias de recuperación, realice los siguientes pasos que se describen a continuación.
1. Convierta los valores de UFC a valores de base logarítmica 10.
El primer paso para calcular la incertidumbre es convertir los valores de UFC a valores logarítmicos en base 10. Esto debe realizarse tanto para los valores inoculados como para los recuperados.
2. Calcule el porcentaje de recuperación de los valores del logaritmo en base 10
Después de convertir sus valores de UFC a logaritmo en base 10, deberá calcular el porcentaje de recuperación. Esto se logra dividiendo el valor recuperado entre el valor inoculado.
3. Calcule la media de los valores porcentuales de recuperación
A continuación, calcule la media (es decir, el promedio) de sus valores porcentuales de recuperación.
4. Calcule la desviación estándar de los valores porcentuales de recuperación
Además, calculará la desviación estándar de sus valores porcentuales de recuperación.
5. Elija un factor de cobertura
Ahora, debe elegir un factor de cobertura que le proporcione una confianza aproximada del 95 %. Puede optar por usar un factor de cobertura de 2 o usar la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura adecuado según sus grados de libertad.
CONSEJO PROFESIONAL : Si tiene 20 o más muestras, generalmente es aceptable utilizar un factor de cobertura de 2. De lo contrario, se recomienda que utilice la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura apropiado para el tamaño de su muestra.
6. Calcular la incertidumbre expandida
Finalmente, calculará su incertidumbre expandida. Esto se logra multiplicando el factor de cobertura por la desviación estándar calculada en el paso 4.
Método 3
Muestras de control de laboratorio con los mismos valores objetivo
Este método estima la incertidumbre de medición en los resultados de pruebas microbiológicas mediante la evaluación de la desviación estándar combinada de muestras de control de laboratorio. El objetivo es determinar la precisión intermedia de las muestras de control de laboratorio como método para estimar la incertidumbre de medición.
Este método se recomienda cuando las muestras de control de laboratorio han pasado por todos los pasos del procedimiento del laboratorio.
En caso contrario, deberá incorporar fuentes adicionales de incertidumbre a su cálculo y utilizar el método de la suma de cuadrados para combinarlas con la desviación estándar agrupada calculada.
Algunas fuentes de incertidumbre que puedes considerar incluyen:
- Submuestreo
- Aliquotación
- Preparación de muestras
Puede encontrarse más información sobre este método en el Anexo A2LA P103b: Política sobre estimación de la incertidumbre de la medición para laboratorios de pruebas de ciencias biológicas para métodos de categoría III .
En la imagen a continuación, verá una captura de pantalla de la calculadora de incertidumbre que creé en Excel para estimar la incertidumbre utilizando este método.
Para estimar la incertidumbre de la medición en microbiología utilizando muestras de control de laboratorio, realice los siguientes pasos que se describen a continuación.
1. Convierta los valores de UFC a valores de base logarítmica 10.
El primer paso para calcular la incertidumbre es convertir los valores de UFC a valores de base logarítmica 10.
2. Calcule la desviación estándar de los valores del logaritmo en base 10.
A continuación, calculará la desviación estándar de los valores del logaritmo en base 10.
3. Elija un factor de cobertura
Ahora, debe elegir un factor de cobertura que le proporcione una confianza aproximada del 95 %. Puede optar por usar un factor de cobertura de 2 o usar la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura adecuado según sus grados de libertad.
CONSEJO PROFESIONAL: Si tiene 20 o más muestras, generalmente es aceptable utilizar un factor de cobertura de 2. De lo contrario, se recomienda que utilice la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura apropiado para el tamaño de su muestra.
4. Calcular la incertidumbre expandida
Por último, calcule su incertidumbre expandida multiplicando el factor de cobertura del paso 3 y la desviación estándar que calculó en el paso 2.
Método 4
Datos de validación del método de laboratorio
Este método estima la incertidumbre de la medición en los resultados de microbiología utilizando datos de un estudio de validación de métodos interlaboratorio, pruebas de repetibilidad interna y una estimación del sesgo.
El objetivo de este método es estimar la incertidumbre que es adecuada para el uso en el laboratorio y determinar si se puede demostrar de manera competente el método de manera consistente con los laboratorios en el estudio de validación.
Este método se recomienda para laboratorios que hayan completado u obtenido los resultados de un estudio de validación apropiado que incluya todas las partes del procedimiento de medición.
En caso contrario, deberá incorporar fuentes adicionales de incertidumbre (por ejemplo, submuestreo, preparación de la muestra, etc.) en su cálculo y utilizar el método de la suma de cuadrados para combinarlas con la reproducibilidad calculada.
Además, su laboratorio debe aceptar que la reproducibilidad del estudio de validación resultará en una sobreestimación de la incertidumbre.
Puede encontrar más información sobre este método en la norma ISO 21748: Guía para el uso de estimaciones de repetibilidad, reproducibilidad y veracidad en la estimación de la incertidumbre de la medición .
En la imagen a continuación, verá una captura de pantalla de la calculadora de incertidumbre que creé en Excel para estimar la incertidumbre utilizando este método.
Para estimar la incertidumbre de la medición en microbiología utilizando datos de validación de métodos, realice los siguientes pasos que se describen a continuación.
1. Determinar la repetibilidad de la validación del método
Determine la repetibilidad de su estudio de validación de métodos y verifique que los resultados sean adecuados para su laboratorio.
2. Determinar la reproducibilidad de la validación del método
Determine la reproducibilidad de su estudio de validación de métodos y verifique que los resultados sean adecuados para su laboratorio.
3. Calcule la desviación estándar entre laboratorios
Una vez que haya determinado la repetibilidad y reproducibilidad del estudio de validación, es momento de calcular la desviación estándar entre laboratorios.
Esto se logra utilizando el método de la suma de cuadrados para combinar la repetibilidad y la reproducibilidad en cuadratura. Consulte la ecuación a continuación para obtener ayuda.
4. Estimar el sesgo de laboratorio
Ahora que conoce la desviación estándar entre laboratorios, es momento de estimar su sesgo de laboratorio.
Esto se puede lograr de una de las siguientes maneras:
- Medición repetida de materiales de referencia,
- Comparación con un laboratorio de referencia, o
- Pruebas de competencia
Después de seleccionar un método y recopilar los datos, deberá usar la siguiente ecuación para calcular el sesgo de laboratorio. Es importante saber que el sesgo de laboratorio debe calcularse utilizando valores logarítmicos en base 10 convertidos.
5. Estimación de la repetibilidad del laboratorio
A continuación, deberá estimar la repetibilidad de laboratorio (Si) utilizando un estudio interno de resultados de pruebas repetidas en condiciones similares.
Para lograr esto, debe recolectar de 20 a 30 muestras repetidas y calcular la desviación estándar a partir de los resultados de la prueba .
6. Calcule el límite de sesgo aceptable
Calcule el límite de sesgo aceptable multiplicando la desviación estándar del laboratorio (del paso 3) por 2.
Si su sesgo de laboratorio es menor que el límite de sesgo , entonces utilice el sesgo de laboratorio.
Si el sesgo de su laboratorio supera el límite de sesgo , su procedimiento no es adecuado. Por lo tanto, deberá evaluar su método para corregir la razón por la que sus resultados exceden los límites.
7. Calcule el límite de precisión de aceptación
Calcule el límite de precisión multiplicando la repetibilidad de su método por 1,5.
Si la repetibilidad de su laboratorio es menor que su límite de precisión , entonces la repetibilidad es aceptable para su método.
Si la repetibilidad de su laboratorio es mayor que su límite de precisión , entonces necesitará ampliar su incertidumbre provisional utilizando la siguiente ecuación;
Si la repetibilidad de su laboratorio es mucho menor que la repetibilidad de su estudio de validación de métodos, entonces puede ser conveniente reducir su incertidumbre provisional utilizando la ecuación anterior.
8. Añadir influencias de incertidumbre adicionales
En este paso, querrá agregar cualquier componente adicional que influya en la incertidumbre y que no se incluyó en el experimento de validación.
Algunas influencias a considerar;
- Submuestreo
- Preparación de muestras
- Reactivos
- Condiciones ambientales
Para agregar influencias de incertidumbre adicionales a la estimación de incertidumbre provisional, utilice la siguiente ecuación para calcular su incertidumbre estándar combinada;
9. Elija un factor de cobertura
Ahora, debe elegir un factor de cobertura que le proporcione una confianza aproximada del 95 %. Puede optar por usar un factor de cobertura de 2 o usar la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura adecuado según sus grados de libertad.
CONSEJO PROFESIONAL: Si tiene 20 o más muestras, generalmente es aceptable utilizar un factor de cobertura de 2. De lo contrario, se recomienda que utilice la tabla T de Student para encontrar el factor de cobertura apropiado para el tamaño de su muestra.
10. Calcular la incertidumbre expandida
Por último, calcule su incertidumbre expandida multiplicando el factor de cobertura del paso 9 y la incertidumbre combinada que calculó en el paso 8.
Cálculo de la incertidumbre para resultados de laboratorio posteriores
Ahora que ha calculado su incertidumbre expandida , lo más probable es que necesite usarla para estimar la incertidumbre de los resultados de pruebas futuras.
Para lograr esto, deberás realizar los siguientes pasos;
1. Convierte tus datos sin procesar a un valor de base logarítmica 10
Convierta sus datos sin procesar a valores logarítmicos en base 10. Esto se logra fácilmente utilizando la siguiente función de Excel:
=LOG10(Celda1)
2. Multiplique el valor del logaritmo en base 10 por su incertidumbre expandida
A continuación, multiplique el valor del logaritmo en base 10 calculado en el paso 1 por su incertidumbre expandida.
CONSEJO PROFESIONAL: Convierta su incertidumbre expandida a un porcentaje para facilitar este paso.
3. Sume y reste este valor de su valor de base logarítmica 10.
Ahora, determine el rango de incertidumbre (es decir, los límites superior e inferior).
Primero, calcule el extremo superior del rango agregando el valor calculado en el paso 2 al valor de base logarítmica 10 calculado en el paso 1.
En segundo lugar, calcule el extremo inferior del rango restando el valor calculado en el paso 2 al valor de base logarítmica 10 calculado en el paso 1.
4. Calcule el antilogaritmo de cada valor calculado en el paso 3.
Ahora, convierta los valores calculados en el paso 3 a UFC usando la función antilogaritmo. Para ello, utilice el número 10 y elévelo a la potencia del valor calculado en el paso 3. Utilice la ecuación a continuación como guía.
5. Redondea hacia abajo el valor en el extremo inferior y hacia arriba el valor en el extremo superior.
Finalmente, redondea cada valor a un número entero. Sin embargo, hay una trampa: debes redondear el valor en el extremo inferior del rango a un número entero, y el valor en el extremo superior del rango a un número entero.
Por ejemplo, si el valor en el extremo inferior del rango es 79,8, redondéelo hacia abajo a 79. Si el valor en el extremo superior del rango es 248,3, redondéelo hacia arriba a 249.
Para simplificar todo este proceso, he añadido esta función a mi calculadora de incertidumbre de Microsoft Excel para que los límites superior e inferior se calculen automáticamente. Estas son las funciones que utilicé para calcular los valores superior e inferior en Microsoft Excel:
=REDONDEAR.MENOR(10^(Valor Log10*(1-Incertidumbre expandida)),0)
=REDONDEAR.MAS(10^(Valor Log10*(1+Incertidumbre expandida)),0)
Más guías sobre incertidumbre para laboratorios de microbiología
Durante mi investigación, pude encontrar varias guías de incertidumbre de medición enfocadas en microbiología que me gustaría compartir con ustedes.
Utilice los enlaces a continuación para obtener más información sobre el cálculo de la incertidumbre de medición para laboratorios de microbiología.
1. Estimación de la incertidumbre de la medición para el procedimiento de microbiología por FASC
3. Incertidumbre de medición en pruebas microbiológicas por Mjikisile Vulindu
5. P19 – Política de incertidumbre de medición de CALA
Conclusión
Calcular la incertidumbre de medición para métodos microbiológicos ha sido un desafío para muchos laboratorios que buscan la acreditación. No impida que su laboratorio obtenga la acreditación ISO/IEC 17025 por no haber implementado un proceso para calcular la incertidumbre.
Pruebe estos 4 métodos e incorpore los que mejor le funcionen en su sistema de gestión de calidad. Si necesita ayuda, pruebe mi calculadora de incertidumbre de medición para laboratorios de microbiología o contácteme en [email protected] .
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